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酪氨酸蛋白激酶调控心肌延迟整流钾电流慢成分的作用、机制及病理意义
2010-06-21 15:05   发布范围:公开

Effects and mechanisms of protein tyrosine kinases on slow component of cardiac activated delayed rectifier potassium current and its pathological significance

董明清,王晓斌,孙东东,刘毅,张博,罗颖

申请摘要:

心肌延迟整流钾电流慢成分Iks是参与动作电位复极的重要外向离子流,Iks通道功能异常是引发多种心律失常的重要原因,研究Iks通道特性与调控机制具有重要临床意义。离子通道磷酸化和脱磷酸化是其功能调控的主要形式,此方面研究虽已有不少,但酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)能否调控人心肌Iks目前尚不清楚。本研究在建立稳定表达人心肌Iks通道蛋白细胞系的基础上,应用膜片钳、定点突变、western blot、动物模型复制等技术,研究PTKs对人心肌Iks有无调控作用及Iks通道蛋白上参与PTK调控的酪氨酸位点,并观察慢性心衰时Iks通道蛋白磷酸化水平的变化,以明确PTKs对人心肌Iks的调控作用、机制及在心衰中的初步病理意义。研究结果不仅将丰富对Iks通道调控及慢心衰时心律失常发生机制的认识,也将为心律失常的诊断、治疗及新型抗心律失常药物开发提供新思路。

结题摘要:

磷酸化修饰是钾离子通道功能重要调控方式,我们对酪氨酸蛋白激酶对人心肌延迟整流钾电流慢成分IKs的调控作用和机制进行了研究。首先建立了稳定表达人心肌Iks通道蛋白的HEK293细胞系;膜片钳实验发现多种PTKs抑制剂对IKs具有明显的抑制作用,此作用可被酪氨酸磷酸酶抑制剂翻转,表明PTKs对IKs具有明显的调控作用;免疫沉淀及western blot实验提示PTKs调节IKs的作用可能是间接作用;进一步对IKS通道α亚基KCNQ1蛋白上可能的酪氨酸磷酸化位点进行的突变实验表明,部分酪氨酸位点突变后IKs通道对PTKs抑制剂反应性无明显变化,其余位点突变后可能影响了通道蛋白的运输过程或空间结构,转染的细胞膜上未能记录到IKs电流,说明KCNQ1蛋白上可能不存在调节IKs电流的酪氨酸磷酸化位点,PTKs对IKs的调控是一种间接作用。本项目的研究结果丰富了人们对Iks通道调控机制的认识,建立的细胞系为IKs通道调控剂筛选奠定了基础。

Abstract:Phosphoralation plays a key role in the regulation of potassium channels. In this project the effects and mechanisms of PTKs on human slow delayed rectifier potassium current (IKs) were studied. We established the stable cell line expressing human KCNQ1/KCNE1 channels (Iks). Using patch clamp technic, we found that wide spectrum PTK inhibitors significantly suppressed IKs current and the tyrosine phosphatase inhibitor could almost reverse the inhibition, suggesting that PTK obviously regulate IKs channels. The results of immunoprecipatation and western blot show the regulation of PTK on Iks is indirect. Then we mutated the possible Tyr sites of KCNQ1 protein, which is the pore forming alpha subunit of Iks, and found that some mutations did not affect the inhibition of PTKs and others produced no current in the transfected cells, which may be due to the deficient of trafficking and/or structure. These results indicated that there are no tyrosine phosphoralation site in the Iks channels and the regulation of PTKs on Iks is in an indirect manner. The findings shed new ligh on the machanisms of Iks regulation and the established cell line affords a ideal model for screen of IKs regulator.

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